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總蛋白和膜蛋白提取方法

膜蛋白具有多種功能,在細胞識別、細胞信號轉導、運輸等有著中著重要的角色,因此也是極佳的藥物靶點。抽提膜蛋白主要是進行蛋白組分析:常用的實驗是非變性膠電泳、酶活分析、SDS-PAGE、western blot 等。本文敘述了總蛋白的抽提方法、和膜蛋白的提取方法。 

一、從新鮮樣品中提取總蛋白(簡易法) 

1.  自配裂解液(pH 8.5-9.0):50 mM Tris-HCl,2 mM EDTA , 100 mM NaCl,0.5% Triton X-100,調pH值至8.5-9.0備用;用前加入100 μg/ml 溶菌酶,1 μl/ml 的蛋白酶抑制劑PMSF。該裂解液用量為10-50 ml 裂解液/1 g濕菌體。 

2.  將40 ml 菌液在12000 g,4 ℃下離心15分鐘收集菌體,沉淀用PBS懸浮洗滌2遍,沉淀加入1 ml裂解液懸浮菌體。 

3.  超聲粉碎,采用300 w,10 s超聲/10 s間隔,超聲20 min,反復凍融超聲3次至菌液變清或者變色。

4.  1000 g離心去掉大碎片,上清可直接變性后PAGE電泳檢測,或者用1% SDS溶液透析后凍存。

缺點:Western blotting結果表明,疏水性跨膜蛋白提取效率有限。

二、從Trizol裂解液中分離總蛋白

1.  Trizol溶解的樣品研磨破碎后,加氯仿分層,2-8 ℃下10000 g離心15 min,上層水相用于RNA提取,體積約為總體積的60%。

2.  用乙醇沉淀中間層和有機相中的DNA。每使用1 ml Trizol加入0.3 ml無水乙醇混勻,室溫放置3 min,2-8 ℃不超過2000 g離心5 min。

3.  將上清移至新的EP管中,用異丙醇沉淀蛋白質。每使用1 ml Trizol加入1.5 ml異丙醇,室溫放置10 min,2-8 ℃下12000 g離心10 min,棄上清。

4.  用含有0.3 M 鹽酸胍的95%乙醇洗滌。每1 ml Trizol加入2 ml洗液,室溫放置20 min, 2-8 ℃下7500 g離心5 min,棄上清,重復洗滌2次。最后加入2 ml無水乙醇,渦旋后室溫放置20 min,2-8 ℃下7500 g離心5 min,棄上清。

5.  冷凍干燥5-10 min,1%SDS溶液溶解,反復吹打,50 ℃溫浴使其完全溶解,2-8 ℃下10000 g離心10 min去除不溶物。

6.  替代方案:將3中的酚醇上清液移至小分子量透析袋中,在2-8 ℃的1% SDS溶液中透析3次,1000 g離心10 min去除沉淀,上清可直接用于蛋白實驗。

三、從新鮮樣品中提取疏水性膜蛋白(Triton X-114去污劑法)

1.  配制疏水性蛋白提取液(非裂解液):1% Triton X-114,150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl,1 mM EDTA,調pH值至8.0備用。

2.  菌液于4 ℃條件下15000 g離心15 min收集菌體;用1 ml 含有5 mM MgCl2 的PBS洗滌3次,最后于4 ℃條件下15000 g離心15 min收集菌體。

3.  菌體沉淀加入1 ml冷提取液,于4 ℃條件下放置2 h,17000 g離心10 min,去除沉淀取上清。

4.  將上述上清中的Triton X-114含量增加到2%,再加入20 mM的CaCl2抑制部分蛋白酶活性,37 ℃條件下放置10 min使其分層。室溫下1000 g離心10 min使液相和去污相充分分層。

5.  將液相和去污相分開,分別用10倍體積的冷丙酮在冰上沉淀45 min。

6.  于4 ℃條件下17000 g離心30 min,用去離子水洗滌沉淀3次。

7.  將沉淀溶解在1% SDS溶液中,測定蛋白濃度,比較液相和去污相中蛋白提取效率,一般是去污相中疏水性膜蛋白較多,適于進一步蛋白實驗。

8.  SDS-PAGE進一步分析液相和去污相的蛋白圖譜。